【摘要】 目的 观察在生理和病理情况下,骨髓来源的干细胞(BMSC)能否分化成肾小管上皮细胞。 方法 绿色荧光蛋白(GFP)标记的C57BL/6转基因小鼠提供骨髓细胞。同种无荧光标记的C57BL/6小鼠100只分为正常对照组、全身照射组、缺血再灌注组、骨髓移植组、骨髓移植+缺血再灌注组。受体鼠的骨髓重建经血液常规检查和流式细胞仪检测确认,并采用荧光组织化学、免疫组织化学等方法观察绿色荧光标记的BMSC在受体鼠肾脏的分布及数量。 结果 全身致死剂量γ射线照射未造成小鼠肾脏组织结构和生理功能的明显改变。骨髓移植后第56、84天的受体鼠肾小管中有少量GFP阳性细胞的存在[(78.75±5.99)%、(79.58±4.60)%],激光共聚焦显微镜进一步证实这些细胞位于肾小管,并表达肾小管上皮细胞特异性的功能蛋白megalin。 结论 在生理和病理情况下,骨髓干细胞均可以向肾小管上皮细胞转分化,参与肾小管上皮细胞的更新,并且在急性肾小管坏死的病理条件下,骨髓干细胞的肾向转化率与肾脏受损程度有关。
目的 研究线粒体蛋白Smac/Diablo和细胞X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在ATP耗竭及再恢复导致肾小管上皮细胞凋亡中的作用和机制。 方法 应用代谢抑制剂暂时性阻断人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)内ATP的生成,再换用含糖的培养液使细胞内ATP再恢复,诱导肾小管上皮细胞凋亡。应用Hoechst33342检测肾小管上皮细胞凋亡的发生。用间接免疫荧光检测Smac/Diablo在细胞内的分布。分别提取胞质蛋白和细胞总蛋白,以Western印迹检测胞质中Smac/Diablo、XIAP和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3前体(pro-caspase-3)的蛋白水平。 结果 肾小管上皮细胞内ATP耗竭及再恢复时,Hoechst33342染色可见HK-2细胞核固缩和凋亡小体的形成;间接免疫荧光可见Smac/Diablo由线粒体释放至胞质;Western印迹可见胞质内Smac/Diablo的含量增多( P < 0.01);XIAP和pro-caspase 3的蛋白水平降低(P < 0.05)。 结论 肾小管上皮细胞内ATP耗竭及再恢复时,Smac/Diablo释放至胞质,XIAP蛋白水平降低,进而激活caspase 3,介导肾小管上皮细胞凋亡。
目的 探讨是否脯氨酸羟化酶2 (PHD2) siRNA 通过减少缺氧诱导因子(HIF)1的降解而减轻缺氧引起的肾小管上皮细胞凋亡。方法 构建针对人PHD2的表达质粒,将其转染到培养的人肾小管上皮细胞系(HKC)中。用RT-PCR方法观察其对PHD2表达的抑制作用。Western印迹观察HIF-1α的表达。培养的HKC细胞分为对照组、模型组和siRNA组、siRNA组经PHD2 siRNA转染后与模型组同时用抗霉素诱导,用Western印迹方法观察3组细胞HIF-1α的表达,用流式细胞仪观察3组细胞的凋亡情况。 结果 经PHD2 siRNA转染的HKC细胞PHD2 mRNA表达明显下调(P < 0.01),HIF-1α蛋白表达明显上调(P < 0.05)。经抗霉素处理后,模型组和siRNA组HIF-1α蛋白表达均明显高于对照组(P < 0.01),但siRNA组HIF-1α蛋白表达高于模型组(P < 0.05。与模型组相比,siRNA组细胞凋亡明显减轻(P < 0.05)。 结论 通过RNA干扰技术抑制PHD2的表达可以增强HKC细胞HIF-1的蛋白表达,从而增强其在缺氧条件下的抗凋亡能力。
目的 观察顺铂致急性肾衰竭(ARF)中肾小管上皮细胞凋亡情况及卡维地洛(carvedilol)对其影响,并探讨其作用机制。方法 雄性Wistar大鼠随机分为盐水对照组、顺铂组、卡维地洛对照组、卡维地洛治疗组。测定BUN、Scr、尿乙酰氨基葡糖苷酶(NAG)、肾组织丙二醛(MDA)与超氧化物歧化酶(SOD)的含量。苏木素-伊红染色(HE)观察肾脏病理改变。原位缺口末端标记法(TUNEL)与DNA电泳观察肾小管上皮细胞的凋亡。Western印迹检测caspase-3的蛋白表达。结果 顺铂组大鼠BUN、Scr、尿NAG升高;肾脏病理改变加重;大量的肾小管上皮细胞凋亡; MDA含量增加,SOD活性降低;caspase-3的蛋白表达增加。上述指标在卡维地洛治疗组均得到改善,BUN从(58.33±19.93)降至(28.74±19.62)mmol/L;Scr从(425.56±97.96)降至(253.90±134.87)μmol/L;NAG从(224.77±75.86)降至(137.52±26.38)U/L;MDA从(18.13±7.01)降至(9.74±1.68)nmol/mg蛋白;SOD从(30.05±12.20)升至(64.67±20.64)U/mg蛋白;caspase-3的蛋白表达从1.94±0.73降至1.25±0.52;细胞凋亡从(42.5±12.6)%降至(23.7±8.4)%;肾组织病理损害也明显改善。结论 肾小管上皮细胞凋亡是顺铂致ARF的重要原因之一。卡维地洛能减轻顺铂的肾毒性,降低肾小管上皮细胞凋亡,其机制可能与减少活性氧(ROS)的产生,部分抑制了caspase依赖的凋亡途径有关。
目的 探讨依贝沙坦在造影剂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用及机制。方法 培养的大鼠肾小管细胞(NRK-52E)分别与不同碘浓度(25、50、100、150 mgI/ml)的安射力(非离子型造影剂)共孵育1 h;安射力(100 mgI/ml)先后刺激NRK-52E细胞0.5、1、2、4 h。与安射力(100 mgI/ml)相同渗透浓度的甘露醇(420 mmol/L)与NRK-52E细胞共孵育1 h作为阳性对照。不同浓度依贝沙坦(0.01、0.1、1 mmol/L)先与NRK-52E细胞共孵育1 h后,安射力(100 mgI/ml)刺激1 h。Hoechst染色和流式AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)水平。RT-PCR检测Bax、Bcl-2 mRNA的表达。 结果 安射力呈浓度和时间依赖性诱导NRK-52E细胞凋亡。与安射力相同渗透浓度的甘露醇不能明显诱导细胞凋亡。安射力与NRK-52E细胞共孵育后,细胞内ROS产生增多,Bcl-2 mRNA的表达下调,Bax mRNA的表达上调。依贝沙坦呈浓度依赖性抑制安射力诱导的NRK-52E细胞凋亡、细胞内ROS的产生、Bcl-2 mRNA表达下调及Bax mRNA表达上调。细胞内ROS水平与细胞凋亡呈正相关。 结论 安射力呈浓度和时间依赖性诱导NRK-52E细胞凋亡,此作用与细胞内氧化应激及bcl-2 mRNA表达下调、Bax mRNA表达上调相关。依贝沙坦能抑制上述安射力的作用,呈浓度依赖性抑制NRK-52E细胞凋亡。
目的 观察基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)过表达对肾小管间质炎症反应的影响。方法 采用人TIMP-1转基因小鼠和野生型小鼠(n = 8)构建单侧输尿管梗阻(UUO)模型。以3 d和14 d为时间点,Masson染色观察肾组织形态学变化,间接免疫荧光法观察肾组织内F4/80阳性细胞的表达;Western 印迹检测TIMP-1、TIMP-2、MMP-2、MMP-9和ICAM-1的蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9的活性,反向酶谱法检测TIMP-1的活性。结果 UUO术后肾小管间质病理损伤加重[肾间质纤维化面积(46.24±6.58)%比野生型(36.33±5.12)%,P <0.05],F4/80阳性细胞数目增加[(68.9±15.6)个/视野比野生型(52.4±13.3)个/视野,P < 0.05],ICAM-1蛋白表达显著上调,术后14 d上述改变在转基因组中更为显著(P < 0.05)。UUO术后TIMP-1蛋白表达及活性上调,在术后14 d达高峰,在转基因组中增加更为显著(P < 0.05)。MMP-2和MMP-9的蛋白表达及活性在术后逐渐下降,UUO术后14 d转基因组降低更为显著(P < 0.05)。结论 TIMP-1过表达可通过增强炎症加重肾小管间质损伤。
目的 通过观察蛋白激酶C (PKC)-alpha基因敲除鼠血清加压素(AVP)水平及髓内水通道蛋白2(AQP-2)分布、表达和转运状态的变化,初步探讨PKC-alpha在小鼠尿浓缩功能中的调节机制。方法 使用代谢箱收集PKC-alpha基因敲除鼠及SV129野生鼠24 h尿液并取血,采用渗透计检测尿渗透浓度。ELISA法检测正常饮食下24 h尿尿素排泄量。放射性免疫法(RIA)检测血清AVP水平。免疫荧光及半定量免疫印迹技术检测小鼠内髓AQP-2的分布和表达情况。分别使用V2受体拮抗剂SR141263及不同浓度去氨基精加压素(DdAVP) 腹腔内注射,检测3 h内尿渗透浓度、尿量以观察两组小鼠AQP-2转运状态。结果 正常饮食下PKC-alpha基因敲除鼠24 h尿尿素排泄量[(3.25±0.18) mmol/24 h比(3.83±0.42) mmol/24 h,P = 0.24]以及血清AVP水平[(4.64±0.43) pmol/L比[(5.03±0.44) pmol/L,P = 0.55]与野生鼠相比,差异均无统计学意义。两组小鼠内髓AQP-2的分布及表达相似(P = 0.48)。不同浓度DdAVP腹腔注射后两组小鼠尿量变化曲线完全一致。SR141263腹腔注射后PKC-alpha基因敲除鼠及野生鼠尿渗透浓度改变之间差异也无统计学意义[(0.20±0.02) mmol/L比(0.20±0.04) mmol/L,P = 0.97]。结论 PKC-alpha参与调节的小鼠尿浓缩功能与血清AVP水平､髓内AQP-2状态无关。
目的 探讨低盐(LS)培养对小鼠致密斑细胞 (MMDD1)环氧化酶2 (COX-2)表达、前列腺素E2(PGE2)释放的诱导作用及p38丝裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号通路的调控作用。方法 采用RT-PCR和免疫印迹方法检测正常盐(NS)与LS培养对MMDD1细胞COX-2表达的影响。用ELISA法检测上清液PGE2的含量。用免疫印迹检测细胞内p-p38 MAPK表达的变化。 结果 与NS培养相比,LS培养均能诱导MMDD1细胞COX-2 mRNA和蛋白表达增加(16 h时高峰 mRNA 0.94±0.12比0.26±0.09,28 h时高峰蛋白0.59±0.02比0.25±0.07,P均< 0.01);PGE2分泌各时间点均显著升高,于24 h达高峰 [(644.33±26.54)ng/L比(224.0±18.33)ng/L, P < 0.01。LS培养后,MMDD1细胞内p38MAPK的磷酸化程度显著上调,180 min时较高(从0.17±0.01升至0.28±0.01,P < 0.01)。20 μmol/L p38抑制剂SB-203580下调 LS诱导的COX-2蛋白表达(从0.58±0.01降至0.19±0.02, P < 0.01)。 结论 低盐培养促进MMDD1细胞COX-2的表达和PGE2的分泌。p38 MAPK激活介导了低盐诱导的MMDD1细胞COX-2表达。
